PCR是一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，加入熒光標(biāo)記的探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能。其原理是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強度成比例增加；每次循環(huán)后采集熒光強度信號，通過熒光強度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到熒光擴(kuò)增曲線。
隨著臨床醫(yī)學(xué)和生物診斷試劑的發(fā)展，為滿足臨床需要，需要開發(fā)一種不需要低溫儲存和運輸?shù)臒晒釶CR擴(kuò)增試劑。由于熒光PCR反應(yīng)體系中含有活性酶、熒光探針等試劑，需要低溫保存，以免其化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，因此需要冷凍干燥。凍干熒光PCR試劑的主要方法步驟包括：
1、液體準(zhǔn)備。熒光PCR擴(kuò)增緩沖液、引物、探針、酶和凍干保護(hù)劑按配方混合，凍干保護(hù)劑的選擇非常重要。常見的凍干保護(hù)劑包括糖類、多元醇、聚合物、表面活性劑、氨基酸、鹽類等。一種可凍干的保護(hù)劑通常含有一種以上的保護(hù)劑，但也可以組合使用多種保護(hù)劑。然而，凍干保護(hù)劑配方的探索是一個耗時的過程，也是凍干成功的關(guān)鍵。
2、冷凍干燥。準(zhǔn)備好上述可凍干反應(yīng)試劑，分裝成PCR八管或定制PCR管，然后放入PCR分子凍干機，開始整個凍干過程。冷凍干燥過程通常分為三個不同的階段：預(yù)冷凍階段、初級干燥階段和次級干燥階段。在預(yù)凍階段，溫度一般在-50～-40℃保持2-3H。預(yù)凍后，保持凍干機內(nèi)溫度不變，開始抽真空至5-10pa，保持10-20h。升華后，將凍干機內(nèi)部溫度升至-35~-25℃并在真空下保持1-2h，然后繼續(xù)將凍干機內(nèi)部溫度升至-5~5℃并保持1-真空下2h。最后，在真空下繼續(xù)將凍干機內(nèi)部溫度升至25-35℃，保持10-12h。凍干后可通入氮氣，然后按下塞子即可完成整個凍干操作。凍干法制備的熒光PCR試劑可在室溫避光保存。它性質(zhì)穩(wěn)定，易于運輸和使用。使用時只需加入溶解液或稀釋劑即可。
PCR分子凍干機采用不銹鋼板設(shè)計，保證箱體表面光潔度，從而保證無菌要求。所設(shè)計的板層強度高，可保證在長期使用過程中對壓蓋無滲漏、變形和影響。板層通過機械加工可以保證對平整度要求高，平整度好，凍干箱板層溫度均勻性好。板層控制溫度-55～70℃，控制溫度范圍寬，加熱和冷卻溫度可控，效率高。冷阱的極限溫度≤-85℃，可對-50以上的任何共晶點進(jìn)行凍干，適用范圍廣，對低共晶點溫度的分子試劑更安全。
